Thèses

L’équipe de Laurent Kremer "Pathogénie Mycobactérienne et Nouvelles Cibles Thérapeutiques" (IRIM, Montpellier) recherche un étudiant en thèse

Modalités d’action, intérêt thérapeutique et études précliniques de la bédaquiline vis-à-vis des infections à Mycobacterium abscessus dans la mucoviscidose

Mycobacterium abscessus est une mycobactérie non tuberculeuse apparaissant depuis quelques années comme un pathogène important, responsable d’infections pulmonaires sévères chez les sujets atteints de mucoviscidose. Elle représente l’espèce mycobactérienne la plus résistante aux antibiotiques, laissant peu d’options thérapeutiques disponibles au clinicien.

L’objectif de la thèse consistera à évaluer et décrire l’activité anti-M. abscessus de la bédaquiline (BDQ), une nouvelle molécule récemment mise sur le marché dans le traitement de la tuberculose multi-résistante.

L’étude consistera i) à caractériser l’activité de la BDQ (seule ou en combinaison avec d’autres antibiotiques) à la fois in vitro et in vivo à l’aide de modèles cellulaires (amibe, macrophage) et animaux (zebrafish et souris) complémentaires ; ii) à étudier les mécanismes de résistance de la BDQ, en combinant des techniques de génétique et de biochimie, pour révéler son mode d’action chez M. abscessus.

La thèse, financée par Vaincre la Mucoviscidose, s’effectuera sur deux sites, à Montpellier (IRIM) et à l’Université de Saint-Quentin en Yvelines (laboratoire du Pr JL Herrmann).

Les candidats intéressés peuvent contacter les deux responsables aux adresses suivantes :
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Régulation de l’autophagie par les protéines du VIH-1

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L’équipe a démontré que l’enveloppe du VIH-1 (Env) module l’autophagie dans ses cellules cibles. En particulier, dans les cellules T CD4 où la réplication du virus est abortive, Env induit une autophagie massive qui conduit à l’apoptose. L’autophagie est donc responsable, du moins en partie, de l’immunodéficience liée à ce virus. Au contraire, l’autophagie est totalement bloquée dans les cellules T CD4 productivement infectées, suggérant qu’une ou plusieurs protéines virales sont capables d’inhiber ce processus. Le projet est donc de découvrir comment l’autophagie est bloquée dans ces cellules infectées. Nous sommes en train d’étudier Vpr, une protéine virale incorporée dans les virus et possédant de multiples fonctions dont l’arrêt du cycle cellulaire, l’apoptose et l’import nucléaire de l’ADN viral. Par technique de double hybride, nous savons que Vpr se lie à plusieurs protéines de l’autophagie (ATG) dont BNIP3, une protéine mitochondriale capable d’induire l’autophagie et l’apoptose, et ULK1, ATG indispensable à l’étape d’initiation de l’autophagie. Des premiers résultats montrent que Vpr venant du virus diminue l’autophagie lors des premières étapes de l’infection des cellules T CD4. Le principal objectif de ce projet est de comprendre comment  Vpr agit sur l’autophagie et le rôle de l’interaction entre Vpr et BNIP3 et/ou ULK1 dans cet effet. Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le dialogue entre autophagie et VIH-1 afin de proposer, à terme, de nouveaux espoirs thérapeutiques.

Klionsky DJ, …Biard-Piechaczyk, ... Espert L, … Zughaier SM. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 2016,12(1):1-222.
Sophie Sagnier, Coralie F. Daussy, Sophie Borel, Véronique Robert-Hebmann, Mathias Faure, Fabien P. Blanchet, Bruno Beaumelle, Martine Biard-Piechaczyk and Lucile Espert. Autophagy restricts HIV-1 infection by selectively degrading Tat in CD4+ T lymphocytes. J Virol. 2015, 89(1):615-25. Article online in Global Medical Discovery (https://globalmedicaldiscovery.com/)
Sophie Borel, Véronique Robert-Hebmann, Jamal Alfaisal, Ashish Jain, Mathias Faure, Lucile Espert, Laurent Chaloin, Jean-Christophe Paillart, Terje Johansen, Martine Biard-Piechaczyk. HIV-1 Vif interacts with LC3 and inhibits autophagy. AIDS, 2015 29 :275-286.
Papin, CF. Daussy, J. Alfaisal, L. Espert, FP. Blanchet, J. Blanco, M. Biard-Piechaczyk. Autophagy and HIV infection. Encyclopedia of AIDS, 2015.
Alfaisal, C.F. Daussy, F.P. Blanchet, Lucile Espert, Sara Salinas, M. Biard-Piechaczyk. To eat or not to eat: the intricate relationship between autophagy and HIV-1. Current Topics in Virology. 2014, 12:23-51.

Etudes structurale et fonctionnelle de protéines impliquées dans la synthèse et le transport des acides mycoliques chez Mycobacterium tuberculosis

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Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, 9.6 millions de personnes ont développé la tuberculose et 1.5 millions de personnes en sont mortes en 2014. Cette mortalité reste très élevée en raison de la co-infection avec le VIH, de la difficulté à diagnostiquer la maladie et de l’émergence de souches multi- et ultra-résistantes de Mycobacterium tuberculosis aux antibiotiques. Ainsi, pour enrayer la progression de la maladie, il s’avère urgent de développer des stratégies thérapeutiques innovantes, basées sur la découverte et la caractérisation de nouvelles cibles pharmacologiques.

La composition extrêmement hydrophobe de la paroi de M. tuberculosis, liée à la présence d’acides gras à très longues chaines carbonées (les acides mycoliques), rend le bacille intrinsèquement résistant à la plupart des antibiotiques, limitant ainsi les possibilités de traitement. Paradoxalement, les enzymes impliquées dans la synthèse de la paroi représentent une source de cibles thérapeutiques potentielles. Dans ce contexte, nous étudions les enzymes impliquées dans la synthèse, le recyclage et le transport de composants de l’enveloppe mycobactérienne.

Le projet de thèse concernera l’étude structurale et fonctionnelle de protéines impliquées dans la synthèse/transport des acides mycoliques chez M. tuberculosis. Ces études utiliseront des techniques variées incluant la biologie moléculaire, la microbiologie (cultures mycobactériennes, création de mutants), la biochimie (production et purification de protéines recombinantes, enzymologie), la biologie structurale (cristallographie aux rayons-X et cryo-microscopie électronique) et la bioinformatique.

Ce projet permettra de révéler la contribution de nouveaux gènes dans le métabolisme de la paroi et la virulence mycobactérienne et de proposer de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique.


Rôle de la protéine RbpA de M. tuberculosis dans la régulation des gènes et de la résistance aux antibiotiques

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Mycobacterium tuberculosis est un agent pathogene humain qui a infecte un tiers de la population mondiale et continue de tuer ~ 1,5 million de personnes chaque annee. La propagation des formes multi-resistantes de la tuberculose (TB-MR) est devenue une menace pour la sante publique dans le monde entier. La majorite des mecanismes de resistance est liee a la regulation de l'activite de l'ARN polymerase bacterienne (ARNP), l'enzyme centrale de la transcription. L’ARNP est la cible de la rifampicine (RIF), antibiotique anti-tuberculeux de premiere ligne. RbpA est une proteine impliquee dans la reponse au stress et a la tolerance au RIF chez Mycobacterium. RbpA est indispensable a la croissance bacterienne et elle peut etre considere comme une cible potentielle pour le developpement de medicaments contre la tuberculose. Recemment, nous avons demontre que RbpA agit comme activateur transcriptionnel stimulant l'ARNP holoenzyme contenant les facteurs d'initiation sigma-A et sigma-B. Le mecanisme moleculaire de cette activation est inconnu. Les objectifs de ce projet sont: (1) explorer le mecanisme moleculaire d'action de la RbpA, (2) son role dans la regulation de l'expression des genes et (3) la sensibilite de l'ARNP aux antibiotiques. Pour ces etudes le systeme de transcription in vitro de M. tuberculosis developpe par notre equipe sera utilise. Les travaux comprendront la caracterisation genetique de l'interface RbpA-ARNP par mutagenese dirigee et la caracterisation biochimique des effets des mutations sur la transcription. Nous etudierons egalement l'effet de RbpA sur la tolerance aux antibiotiques: RIF, ses analogues et la lipiarmycin.

Morichaud Z, Chaloin L, Brodolin K. Regions 1.2 and 3.2 of the RNA polymerase sigma subunit promote DNA melting and attenuate action of the antibiotic Lipiarmycin. J Mol Biol. 428 (2 Pt B):463-76 (2016).
Hu Y, Morichaud Z, Sudalaiyadum Perumal A, Roquet-Baneres F, Brodolin K. Mycobacterium RbpA cooperates with the stress-response sigmaB subunit of RNA polymerase in promoter DNA unwinding. Nucleic Acids Res. 42(16):10399-408 (2014).
Hu Y, Morichaud Z, Chen S, Leonetti JP, Brodolin K. (2012) Mycobacterium tuberculosis RbpA protein isa new type of transcriptional activator that stabilizes the σA-containing RNA polymeraseholoenzyme. Nucleic Acids Res. 40, 6547-57.
Tupin A, Gualtieri M, Leonetti JP, Brodolin K. (2010) The transcription inhibitor lipiarmycin blocks DNA fitting into the RNA polymerase catalytic site. EMBO J. 29, 2527-37.
Zenkin, N., Kulbachinsky, A., Yuzenkova, Yu., Mustaev, A., Bass,I., Severinov K., Brodolin K. (2007) Region 1.2 of the RNA polymerase sigma subunit controls recognition of the -10 promoter element. EMBO J. 26, 955-64.

Rôle de l’autophagie sélective au cours de l’infection par le VIH-1

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L’autophagie est un mécanisme de dégradation lysosomale ubiquitaire permettant de lutter contre les infections. Cette dégradation peut être hautement sélective grâce à l’intervention de « récepteurs autophagiques », comme p62 ou NDP52, chargés de l’adressage de substrats à la machinerie autophagique grâce à leur interaction avec les protéines de la famille Atg8 (majoritairement LC3). Le rôle de l’autophagie sélective au cours des infections bactériennes est un domaine en pleine évolution, cependant les données concernant son implication au cours des infections virales restent très fragmentaires. Notre équipe a montré que les protéines d’enveloppe du VIH-1 (Env) déclenchent l’autophagie dans les lymphocytes T CD4. Lorsque ces cellules sont infectées de façon productive, le processus autophagique est contrôlé par le virus. Au contraire, lorsque les cellules cibles ne sont pas productivement infectées, car le cycle viral est interrompu après l’étape d’entrée, l’autophagie n’est pas contrôlée et conduit à la mort par apoptose. De nombreux travaux attestent de l’importance du processus autophagique au cours de l’infection par le VIH dans différents contextes cellulaires. Cependant, à l’exception de son rôle sur la protéine virale Tat (travaux de notre équipe), les cibles spécifiques de la dégradation autophagique au cours de l’infection par le VIH ne sont pas connues. Nous avons donc commencé un crible protéomique afin d’identifier les facteurs cellulaires et viraux sélectivement dégradés par autophagie dans différents contextes d’infection par le VIH-1. Après sélection, nous analyserons les conséquences de leur dégradation au cours de l’infection par le VIH. Nous pensons que les résultats obtenus permettront d’ouvrir de nouvelles pistes de recherche, tant sur les mécanismes conduisant à l’apoptose des cellules T CD4 associée à cette infection que sur les stratégies utilisées par le virus pour contrer les défenses cellulaires.

Klionsky DJ, …. Espert L, … Zughaier SM. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 2016 Jan 2;12(1):1-222.
S Sagnier, C Daussy, S Borel, V Robert-Hebmann, M Faure, FP Blanchet, B Beaumelle, M Biard-Piechaczyk and L Espert. Autophagy restricts HIV-1 infection by selectively degrading Tat in CD4+ T lymphocytes. J Virol.  2015 Jan;89(1):615-25.
Daussy CF, Beaumelle B, Espert L. Autophagy restricts HIV-1 infection. Oncotarget. 2015 Aug 8;6(25):20752-3.
Espert L, Beaumelle B, Vergne I. Autophagy in Mycobacterium tuberculosis and HIV infections. Front Cell Infect Microbiol. 2015 Jun 2;5:49.eCollection 2015.
S Borel, V Robert-Hebmann, J Alfaisal, A Jain, M Faure, L Espert, L Chaloin, JC Paillart, T Johansen, M Biard-Piechaczyk. HIV-1 Vif interacts with LC3 and inhibits autophagy. AIDS, 2015 29 :275-286.

Caractérisation du potentiel pathogène et des capacités adaptatives des espèces atypiques de Brucella

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Les brucelles sont des bactéries intracellulaires facultatives hautement infectieuses, responsables de la brucellose, une zoonose bactérienne majeure, transmise à l'homme par contact, ingestion, et inhalation. La description récente d'espèces atypiques de Brucella pose la question de la réémergence éventuelle de la brucellose dans des pays déclarés indemnes. Il s'agit de bactéries issues d'hôtes inhabituels, dont le potentiel pathogène et les voies de transmission éventuelles à l'homme restent inconnus. Parmi ces espèces figurent Brucella microti, Brucella inopinata, et des souches de Brucella sp. isolées d'amphibiens. En dépit de différences phénotypiques importantes, les séquences génomiques des espèces classiques et atypiques sont quasi-identiques. Nous émettons l'hypothèse que ces différences phénotypiques sont dues à une régulation génique différentielle, plutôt qu'à l'existence de gènes spécifiques. L'objet de cette thèse est la caractérisation des stratégies d'adaptation des espèces atypiques de Brucella à différentes conditions environnementales et à l'interaction avec les cellules hôtes.

Ce projet de thèse se structurera en deux parties : (A) Les gènes et les mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance au stress acide de B. microti seront identifiés par analyse transcriptomique comparative, couplée à des études fonctionnelles. Ces études seront étendues à d'autres espèces atypiques de Brucella. (B) Dans un deuxième temps, le potentiel pathogène des espèces atypiques de Brucella sera caractérisé dans des modèles d’infection in vitro. Pour cela, deux approches complémentaires en microbiologie moléculaire et en biologie cellulaire seront mises en œuvre. L'ensemble de ces travaux permettra une meilleure compréhension de la virulence de ces espèces encore peu étudiées.

Jiménez de Bagüés MP, Ouahrani-Bettache S, Quintana JF, Mitjana O, Hanna N, Bessoles S, Sanchez S, Scholz HC, Lafont V, Köhler S, Occhialini A. 2010. The new species B. microti replicates in macrophages and causes death in murine models of infection. J. Infect. Dis. 202: 3-10.
Hanna N, Jimenez de Bagues MP, Ouahrani-Bettache S, El Yakhlifi Z, Köhler S, Occhialini A. 2011. The virB operon is essential for lethality of B. microti in the Balb/c murine model of infection. J. Infect. Dis. 203: 1129-35.
Occhialini A, Jiménez de Bagüés MP, Saadeh B, Bastianelli D, Hanna N, De Biase D, Köhler S. 2012. The glutamic acid decarboxylase system of the new species B. microti contributes to its acid resistance and to oral infection of mice. J. Infect. Dis. 206: 1424-32.
Hanna N, Ouahrani-Bettache S, Drake KL, Adams LG, Köhler S, Occhialini A. 2013. Global Rsh-dependent transcription profile of Brucella suis during stringent response unravels adaptation to nutrient starvation and cross-talk with other stress responses. BMC Genomics. 14: 459.
Damiano MA, Bastianelli D, Al Dahouk S, Köhler S, Cloeckaert A, De Biase D,Occhialini A. 2015. Glutamate decarboxylase-dependent acid resistance in Brucella spp.: Distribution and contribution to fitness under extreme acid conditions. Appl. Environ. Microbiol. 81: 578-586.

Les transporteurs de lipides complexes chez les mycobactéries pathogènes : du gène aux applications pharmacologiques

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L’enveloppe des mycobactéries pathogènes renferme un large éventail de (glyco)lipides complexes impliqués dans la virulence et dans les interactions de la bactérie avec les cellules de hôte infecté. Le transport de ces lipides à travers la paroi reste largement méconnu en dépit du nombre très élevé de transporteurs potentiels présents dans ces bactéries. Nous nous intéressons aux protéines MmpL, appartenant à la superfamille des pompes à efflux qui transportent certains lipides et impliqués dans la physiopathologie infectieuse chez Mycobacterium abscessus, un pathogène émergent responsable d’infections pulmonaires sévères chez les patients atteints de mucoviscidose. Par ailleurs, certaines MmpL semblent intervenir dans la résistance naturelle de M. abscessus à de nombreux antibiotiques.

Nous proposons dans un premier temps d’inactiver plusieurs gènes codant des MmpL chez M. abscessus et d’analyser la composition lipidique des mutants générés afin de déterminer et caractériser leur substrat. Une seconde étape consistera à réaliser une étude spatiotemporelle du  processus infectieux des mutants en utilisant le embryonnaire de zebrafish (Danio rerio) récemment développé dans notre équipe et qui permettra d’appréhender la fonction de ces lipides dans la phagocytose, la survie intracellulaire et le recrutement de cellules amenant à la formation de granulomes. Enfin, la réponse des mutants aux traitements antibiotiques sera également testée. Ce projet, englobant des études génétiques, microbiologiques, biochimiques et combinant des techniques de microinjection et d’imagerie nous renseignera quant au rôle des MmpL dans i) la biogénèse de la paroi, ii) la virulence et iii) la résistance intrinsèque de M. abscessus à l’antibiothérapie classique.


Rôle du cytosquelette d’actine et des acteurs de la courbure membranaire dans l’assemblage du virus HIV-1

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HIV-1 est un virus mortel qui infecte principalement les lymphocytes T CD4 chez l’Homme. Au cours de la formation de la particule virale, les protéines rétrovirales Gag du HIV-1 ciblent et s’assemblent sur le feuillet interne de la membrane plasmique de la cellule infectée. Gag interagit spécifiquement avec des phospholipides, qui peuvent résider dans des nanodomaines membranaires. Ces nanodomaines peuvent contenir des acteurs de la courbure et la dynamique membranaire, dépendante aussi du cytosquelette d’actine situé en dessous. La dynamique d’actine peut régir la réorganisation locale de la membrane et pourrait jouer un rôle dans l’assemblage membranaire de Gag. Parmi les régulateurs sont les petites RhoGTPases et leurs effecteurs. Notre équipe a mis en évidence l’implication de Rac1 sur la localisation membranaire de Gag et la production de virus dans les lymphocytes T Jurkat et primaires. Nos résultats ont montré l’activation de Rac1 et l’implication de la voie de signalisation IRSp53-Wave2-Arp2/3 dans la biogénèse du HIV-1. Ce travail met en exergue un rôle nouveau de cette voie de signalisation lié à la dynamique du cytosquelette d’actine dans la formation des particules virales issues des lymphocytes CD4 T. Nous voulons maintenant caractériser, au niveau moléculaire et cellulaire, le recrutement de ce complexe au niveau du site d’assemblage du HIV-1 dans les lymphocytes T CD4. Pour ce faire, nous avons développé des techniques de biologie cellulaire des membranes et de virologie couplées à des techniques de biophotoniques (FRET/FLIM et FCCS pour les interactions protéines/protéines) et d’imagerie par microscopie super-résolution (double couleur PALM/STORM).

Involvement of the Rac1-IRSp53-Wave2-Arp2/3 Signaling Pathway in HIV-1 Gag Particle Release in CD4 T Cells.
Thomas A, Mariani-Floderer C, López-Huertas MR, Gros N, Hamard-Péron E, Favard C, Ohlmann T, Alcamí J, Muriaux D.
J Virol. 2015 Aug;89(16):8162-81.
Role of Gag and lipids during HIV-1 assembly in CD4(+) T cells and macrophages.
Mariani C, Desdouits M, Favard C, Benaroch P, Muriaux D.
Front Microbiol. 2014 Jun 25;5:312.
Intracellular expression of Tat alters mitochondrial functions in T cells: a potential mechanism to understand mitochondrial damage during HIV-1 replication.
Rodríguez-Mora S, Mateos E, Moran M, Martín MÁ, López JA, Calvo E, Terrón MC, Luque D, Muriaux D, Alcamí J, Coiras M, López-Huertas MR.
Retrovirology. 2015 Sep 16;12:78.
Biocompatible photoresistant far-red emitting, fluorescent polymer probes, with near-infrared two-photon absorption, for living cell and zebrafish embryo imaging.
Adjili S, Favier A, Fargier G, Thomas A, Massin J, Monier K, Favard C, Vanbelle C, Bruneau S, Peyriéras N, Andraud C, Muriaux D*, Charreyre MT*. *co-last authors.
Biomaterials. 2015 Apr;46:70-81.
RNA control of HIV-1 particle size polydispersity.
Faivre-Moskalenko C, Bernaud J, Thomas A, Tartour K, Beck Y, Iazykov M, Danial J, Lourdin M, Muriaux D*, Castelnovo M*.
PLoS One. 2014 Jan 24;9(1):e83874. *co-last authors.

 

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IRIM
Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier
UMR 9004 - CNRS / UM
1919 route de Mende - 34293 Montpellier cedex 5
FRANCE

 

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